MAREAS ROJAS Y TÓXINA AMNÉSICA DE LOS MOLUSCOS

AGENCIA EUROPEA DEL MEDIO AMBIENTE. El medio ambiente en Europa: segunda evaluación. Medio ambiente marino y litoral. Agencia Europea del Medio Ambiente. Copenhague, 1998. ÁLVAREZ, María; FRAGA, Santiago; FRANCO, José M.; LÉGER, Claude; BATES, Stephen S. Pseudo-nitzschia multiseries in culture with nitrate and ammonium as nitrogen sources. Internet: http://www.utas.edu.au/docs/plant_science/HAB2000/ poster_abstracts/docs/Alvarez_Maria_J.html ANDERSON, Donald, D. The Harmful Algae Page. Woods Hole Oceanographic Institution. Woods Hole, 2002. Internet: http://www.redtide.whoi.edu/hab. AUBERT, Maurice. El cultivo del océano. Labor. Barcelona, 1968. AUSTRALIAN INSTITUTE OF MARINE SCIENCE. A Review and Synthesis of Australian Fisheries Habitat Research.2001. Internet: http://www.naa.gov.au/recordkeeping/gov_online/agls/ BALTIC SEA RESEARCH INSTITUTE WARNEMÜNDE. The IOW-Picture Gallery of Baltic microalgae. 2001. Internet: http://www.io-warnemuende.de/research/en_galerie.html BATES; STEPEHN,

Real Decreto 571/1999, de 9 de abril, por el que se aprueba la Reglamentación técnico-sanitaria que fija las normas aplicables a la producción y comercialización de moluscos bivalvos vivos. Propuesta de DIRECTIVA DEL CONSEJO que modifica el Anexo de la Directiva 91/492/CEE por la que se fijan las normas sanitarias aplicables a la producción y puesta en el mercado de moluscos bivalvos vivos DECISIÓN DE LA COMISIÓN de 15 de marzo de 2002 por la que se establecen controles sanitarios especiales para la recolección y transformación de determinados moluscos bivalvos con un nivel de toxina amnésica de molusco (ASP) superior al límite establecido en la Directiva 91/492/CEE del Consejo

Una vez que se conoció el problema de la ASP y la toxina causante, se empezó a trabajar para obtener un instrumento jurídico con el fin de impedir intoxicaciones de estas características, que eran auténticamente graves. En este sentido: - Se modificó el anexo de la Directiva europea 91/492/CEE, por la que se fijan las normas sanitarias aplicables a la producción y puesta en el mercado de moluscos bivalvos vivos, de forma que el porcentaje de "Amnesic Shellfish Poisoning" (ASP) en las partes comestibles de los moluscos (el cuerpo entero o cualquier parte comestible por separado) no deberá sobrepasar los 20 microgramos de ácido domoico por gramo según el procedimiento de análisis HPLC. O sea, esa directiva, por una parte fija en 20 mg de ácido domoico por gramo de tejido la cantidad máxima de ASP, y por otro fija como método de análisis oficial de la misma el análisis por cromatografía líquida de alta resolución HPLC. - En España, la norma aplicable es el Real Decreto 571/1999,

Siguiendo el documento de la FAO “Aseguramiento de la calidad de los productos pesqueros” es evidente que la inspección tradicional es incapaz de eliminar los problemas de la calidad, y es mucho más probable que una estrategia preventiva, basada en un análisis detallado de las condiciones reinantes, proporcione una seguridad de que los objetivos del programa de aseguramiento de la calidad sean satisfechos. Este punto se hizo evidente durante los inicios de la producción e investigación alimentaria de programa espacial de los Estados Unidos (Bauman 1992). La cantidad de ensayos que debían efectuarse, para llegar a un punto de decisión razonable sobre si un alimento era o no aceptable para un viaje espacial, era extremadamente alta. Además del costo, una gran proporción de cada partida de alimentos producida tenía que ser utilizada para los ensayos, quedando solamente disponible para los vuelos espaciales una pequeña parte. El resultado de estas consideraciones iniciales fue el desarr

En el siguiente cuadro se presenta la situación actual en cuanto a las tolerancias y métodos de análisis que se deben utilizar en un programa de control. Cuadro 6.1. Vigilancia de las biotoxinas (WHO 1989) Tomado de PLATT Mc GUINN, Anne. Un nuevo ordenamiento para los océanos. Comisión Colombiana del Océano, . 2001. Internet: http://www.cco.gov.co/spa/lecturas/ordena.htm

El control de las biotoxinas marinas es difícil y las enfermedades no pueden prevenirse por completo. Todas las toxinas son de naturaleza no proteica y extremadamente estables, como es el caso del ácido domoico. Así, el cocinado, ahumado, secado o salado no las destruye, y no puede decirse por el aspecto de la carne del pescado o de los productos pesqueros, si el alimento es o no tóxico, como ocurre con las almejas contaminadas por ácido domoico, las llamadas “almejas amnésicas”. La principal medida preventiva es la inspección y muestreo de las zonas de pesca y de los bancos de moluscos bivalvos o poblaciones de gasterópodos, y el análisis de las toxinas. El bioensayo en ratones se utiliza a menudo para este propósito y se realiza una determinación confirmatoria por la técnica HPLC si la muerte sobreviene después de 15 minutos. Si se encuentran niveles altos de toxinas se interrumpen las capturas comerciales. Parece improbable que algún día sea posible controlar la composición del fito

5.1. Medidas de lucha contra las enfermedades causadas por biotoxinas 5.2. El sistema de análisis de peligros y puntos críticos (HACCP) 5.3. Medidas de control en el Mar Mediterráneo

Figura 5.1. Zonas con más probabilidades de un crecimiento expansivo de Pseudonitzschia , diatomea productora de ácido domoico.

El Mar Mediterráneo es un mar escaso en nutrientes, pero ello no impide la ocasional aparición de mareas rojas en sus aguas. Los lugares más comunes de aparición se encuentran en la costa norte española y francesa, norte del Adriático y Sicilia. 1.- Aparecen en aguas en las que se produce una estratificación de capas, con calentamiento de la superficial, tal como ha ocurrido en los crecimientos explosivos de Pseudonitzschia . 2.- Los meses más proclives en el Mar Mediterráneo son los comprendidos entre marzo y agosto. 3.- Aparecen también en las periferias de afloramientos, en donde exista abundancia de las sustancias orgánicas que son necesarias para su desarrollo. La imagen proporcionada por el satélite Nimbus-7 de la NASA muestra que las áreas del Mediterráneo de más desarrollo del fitoplancton son las más ricas en nutrientes, debido a la combinación entre los nutrientes naturales y la contaminación por nutrientes aportados por la actividad antropogénica. Estas áreas son el Ródano,

El silicio es un componente fundamental para las diatomeas, ya que necesitan silicato en grandes cantidades para formar la frústula o valva que las recubre. Tanto es así que la cantidad de silicio en una diatomea es alrededor del 93 % en peso de la cantidad de carbono, tal como se puede observar en el cuadro 5.1. La concentración de silicio en el agua marina oscila de 100 a 0,1 ppm. En datos tomados en la Bahía de Palma (Islas Baleares), los valores normales se sitúan entre 1,9 y 1,5 mg l-1, con máximos de 4 mg l-1 en mayo y 8 mg l-1 en octubre y noviembre. Comparando la distribución estacional con la de los nitratos resultan ser prácticamente idénticas, destacando que su alta concentración se debe al aporte de aportes exógenos, probablemente terrígenos. Además, la curva suavizada de variación de los silicatos es muy semejante a la de los fosfatos.

Ciertas investigaciones han puesto de manifiesto la enorme importancia que tiene el nitrógeno, ya sea en forma de nitrato o de amonio, para el crecimiento de Pseudonitzschia . Las principales formas inorgánicas en aguas eufóticas son NO3-, NO2- y NH4+ en concentraciones de 2/3, 0,5 y 1/3 mmol N/l, respectivamente. El Mediterráneo es ligeramente deficiente en nitrógeno inorgánico aunque no es la misma cantidad que en fósforo. En áreas oligotróficas pronunciadas, ambos iones proceden únicamente de procesos de regeneración (descomposición de la materia muerta y excreciones) y de nitrógeno atmosférico. En las áreas eutróficas, los nitratos proceden de la descarga de los ríos (de fuente natural), mientras que los iones amonio tienen causa antropogénica. En áreas costeras directamente polucionadas por efluentes, las concentraciones son generalmente muy altas: 35 mmol NO3-/l y 20 mmol NH4+/l. Las formas orgánicas de nitrógeno son también muy importantes en las capas superiores oceánicas, con

La concentración normal de ortofosfato en capas eufóticas de aguas costeras productivas, es de unos 0,3 mmol PO4=/l, descendiendo considerablemente en los períodos de crecimiento explosivo fitoplanctónico. En el océano abierto la concentración está alrededor de 0,1 mmol PO4=/l en la superficie, 1,5 mmol PO4=/l en el Atlántico y 2,8 mmol PO4=/l en el Pacífico e Índico, estos últimos valores para aguas profundas. En el Mediterráneo, los valores son menores: 0,05 mmol PO4=/l en la capa eufótica y 0,3 mmol PO4=/l en aguas profundas. Una gran cantidad de este fósforo llega a través de los ríos por disolución de rocas y suelos continentales. Otra importante cantidad, en tiempos modernos, es de origen humano, llegándose hasta alcanzar 2,0 mmol PO4=/l en los puntos de descarga de algunos efluentes. Debido al carácter oligotrófico del Mar Mediterráneo, parece indiscutible el papel del fósforo como elemento limitante de la productividad. La relación N:P óptima de asimilación (15:1), es ordinaria

En el Mar Mediterráneo, hay que tener siempre presente el aspecto de la productividad primaria. Este mar tiene un carácter oligotrófico, con escasa cantidad de elementos nutrientes y deficiente productividad de la masa fitoplanctónica constitutiva del primer escalón en la escala trófica. En este sentido, sólo el Mar de los Sargazos es comparable en tan baja productividad. El carácter oligotrófico del Mar Mediterráneo y su baja productividad no se corresponden con los rendimientos parciales de su pesca de algunas de sus zonas, en las que se consiguen altas relaciones capturas/productividad primaria general, lo que se explica porque de forma esporádica aparecen mecanismos de aportes notables de nutrientes.

La salinidad en el Mar Mediterráneo es alta, llegándose hasta casi el 39 %o en algunas capas superficiales del Sur de Chipre, mientras que en el estrecho de Gibraltar la salinidad es la ordinaria de aguas atlánticas. A la izquierda y a la derecha de la boca de dicho estrecho aparecen unas haloclinas, produciéndose unas intensas variaciones de la salinidad a los aproximadamente 170 y 90 m de profundidad, traduciéndose en sustanciales diferencias de densidad y en el establecimiento de capas claramente diferenciadas. Las variaciones salinas en todos los mares del mundo son muy pequeñas, debido, lógicamente, a la mezcla existente entre las aguas, sin embargo, ello no impide que existan variaciones y que unas especies estén más adaptadas a un tipo de salinidad que otras. Como se ha visto anteriormente, Pseudonitzschia se halla adaptada a aguas oligohalinas (salinidad baja) y mesohalinas (salinidad media). Por sus características, las aguas mediterráneas no son hiperhalinas (salinidad alta)

Los requisitos de la diatomea Pseudonitzschia , según las investigaciones realizadas, son los siguientes: - Temperaturas: aguas cálidas. - Luz. - Salinidad: aguas oligoahalinas a mesohalinas. - Aguas ricas en nutrientes. Como se puede observar, los requisitos de luz y temperatura, el Mar Mediterráneo podría cumplirlos, en cuanto al resto de los requisitos vamos a analizarlos a continuación.

Hay que señalar el trabajo de Tilman et al. (1981) sobre dos especies de diatomeas de agua dulce: Asterionella formosa y Synedra ulna . En la investigación de laboratorio se registró el impacto de las especies sobre su recurso limitante al mismo tiempo que la densidad de las poblaciones. Ambas especies necesitan silicio en forma de silicato para construir sus paredes celulares. Al cultivar aisladamente cualquiera de las dos especies en un medio líquido al que se añadían continuamente recursos, se alcanzaba una capacidad portadora estable, manteniéndose una concentración portadora estable, manteniéndose una concentración baja constante de silicato. Dicho de otra forma, las diatomeas consumían silicato y al explotar este recurso mantenían su concentración a niveles bajos. Sin embargo Synedra reducía la concentración de silicato hasta el nivel más bajo que Asterionella . Así, cuando las dos especies eran cultivadas juntas, Synedra mantenía la concentración a un nivel que era demasiado

Es muy larga la historia de especies foráneas a lo largo y ancho del planeta, causando enormes desórdenes ecológicos. La especie humana ha traído y ha llevado a numerosas especies por todo el globo. Baste citar al eucalipto australiano, hoy habitante normal de nuestras tierras. Como forma de intercambio, el conejo europeo causa numerosos desórdenes ecológicos en Australia. La lista de especies invasoras, tanto vegetales, animales o microscópicas, sería interminable. Las barreras existentes antes de la llegada del hombre, hoy día ya no existen. Aunque no parece que las aguas mediterráneas sean las preferidas de Pseudonitzschia , ello no es ninguna garantía de que no pueda adaptarse a su nuevo hábitat, pues muchas especies, mediante numerosas estrategias, han sabido adaptarse a un hábitat extraño. Las especies de Pseudonitzschi a encontradas en el Mar Mediterráneo son Pseudonitzschia delicatissima , Pseudonitzschia pseudodelicatissima , y Pseodonitzschia australis .

No es el objetivo del presente trabajo un estudio biológico y ecológico de las diatomeas del género Pseudonitzschia en el Mar Mediterráneo, ya que aunque sería interesantísimo excedería ampliamente los límites del mismo. Este trabajo está desarrollado bajo la base de la Química Oceanográfica y en el tema que tratamos, se basa en las necesidades de nutrientes de Pseudonizschia , que al ser un organismo autótrofo, no necesita depredar sobre otros seres vivos, sino que obtiene su alimentación en el medio marino. Sin embargo, no podemos pasar por alto, que la diatomea Pseudonizschia es un ser vivo, y por tanto, sujeto, por supuesto a las leyes de la Química, pero también a las leyes de la Biología, entrando una gran cantidad de variables sobre su viabilidad en las aguas del Mar Mediterráneo. A pesar de que lo anteriormente dicho, no podemos dejar pasar dos aspectos fundamentales, que nos vemos en la obligación de hacerlo ya que podrían invalidar o no todo el estudio químico que estamos re

Se ha comprobado que los extractos terrígenos añadidos a los cultivos favorecen el crecimiento del plancton y, por tanto, de las diatomeas. Los estudios sistemáticos de Droop, Provasoli, etc., demostraron que estos extractos terrígenos se pueden reemplazar por la aportación de vitaminas: tiamina, vitamina B12, biotina, etc. Estos autores pasaron revista a las necesidades en vitaminas de las algas marinas y de aguas dulces. Lewin demostró que el 14 % de las diatomeas requieren tiamina; 20 % de estas algas, cobalamina, y 70 %, ambos elementos. Tras indicar cuales son los elementos esenciales de este medio de cultivo y de aludir a los mecanismos de los factores de crecimiento, se pueden exponer ya los métodos de cultivo del plancton utilizados en laboratorio. El criadero puede ir hasta el tubo de ensayo hasta la bombona, pasando por la cámara de cultivo. Casi siempre se utilizan en laboratorio matraces de Erlenmeyer de 250 cm3, pero para obtener gran cantidad de fitoplancton para alimenta

Los trabajos de Birge y Chancey, Clarke y Wheeler, seguidos de los de Vinagradov y, en 1942, los de Johnson y Flemming, dedicados al análisis elemental, permitieron evidenciar no solamente los diversos elementos constituyentes (como el Cl, Na, Mg, S, K, Ca y Fe), los oligoelementos (como B, F, Si, Mn, Cu, I, Li, Be, Al, Cr, Co, Ni, Ag) sino que, sobre todo, nos han proporcionado decisiones cuantitativas y cualitativas de los valores y contenidos relativos de los elementos que de manera principal constituyen la materia orgánicas, que principalmente son el oxígeno, el carbono, el hidrógeno, el nitrógeno y el fósforo. Otras investigaciones más detalladas proporcionan datos particularmente interesantes al efectuarse selectivamente, primero sobre organismos animales y después sobre organismos vegetales, finalizando por los de transición. Cuadro 5.1. Composición relativa de los organismos planctónicos (con relación a C = 100) Tomado de AUBERT, Maurice. El cultivo del océano. Labor. Barcelona

Como la especie que produce el ácido domoico es la diatomea Pseudonitzschia , es en esta especie en la que vamos a centrar este estudio. Sobre este ser vivo influyen una serie enorme de variables, tanto físicas, químicas o biológicas. Vamos a dar mayor importancia a las variables de tipo químico, ya que el presente trabajo es un trabajo de química oceanográfica, pero no podemos dejar de olvidar las variables físicas o biológicas, ya que el conjunto de todas es el que nos proporcionará una idea sobre el posible crecimiento explosivo de Pseudonitzschia en las aguas mediterráneas. No obstante, un estudio meramente químico sigue siendo igualmente válido a la hora de evaluar su posible crecimiento, ya que la diatomea tiene unas necesidades, y si una de ellas no se cubre, entonces tendremos la certeza de que su crecimiento explosivo no se producirá.

4.1. Introducción 4.2. Diatomeas y medio ambiente marino 4.3. Las diatomeas del género Peudonitzschia en el Mar Mediterráneo 4.4. Requisitos químicos para un crecimiento explosivo de Pseudonitzschia 4.5. Conclusiones

Como se ha visto en los puntos anteriores, el silicio es un nutriente fundamental para las diatomeas. Está presente en el agua de mar en forma de iones silicato y posiblemente como pequeños trozos de sílice coloidal. Es un constituyente de la pared celular de las diatomeas, los esqueletos de algunos radiolarios y las púas de algunas esponjas. El silicio da lugar a un amplio sistema por cuanto aparecen formas silíceas anhidras e hidratadas, en equilibrio con formas particuladas pertenecientes algunas veces a minerales de compleja formulación química. Además participa en determinados procesos geológicos y biológicos, como es la síntesis de diatomeas fitoplanctónicas. Debido a su connotación biológica esta considerado como uno de los llamados elementos nutrientes, y su concentración, igual que ocurre con los otros nutrientes, nitrógeno y fósforo, presenta una notable dependencia estacional. La concentración de silicatos en la superficie es anormalmente baja, aunque aumenta con la profundi

Figura 3.8. Imagen de Pseudonitzschia multiseries Figura 3.8. Imagen de Pseudonitzschia pungens Imágenes tomadas de ANDERSON, Donald, D. The Harmful Algae Page . Woods Hole Oceanographic Institution. Woods Hole, 2002. Internet: http://www.redtide.whoi.edu/hab. Se han encontrado otros tipos de diatomeas que también son productoras de ácido domoico, como los géneros Alsidium, Amphora y Palmaria , sin embargo el género Pseudonitzschia es el auténticamente representativo del fenómeno.

El género Pseudonitzschia son diatomeas pennadas, pertenecientes a la familia Bacillariaceae . Pseudonitzschia multiseries fue identificada como tóxica en 1987, cuando 150 personas fueron intoxicadas y tres murieron, después de comer mejillones azules en la isla Príncipe Eduardo (Canadá). Las condiciones óptimas de crecimiento son aguas superficiales cálidas que son colocadas por temperatura. Existen varias especies productoras de ácido domoico, pertenecientes al género Pseudonitzschia. En Escocia, en varios estudios realizados se ha llegado a la conclusión de que la especie dominante en esas aguas es Pseudonitzschia australis . En estas mismas investigaciones se ha comprobado que el crecimiento de la diatomea depende de varias condiciones ambientales, como son la temperatura, salinidad, luz y nutrientes. Todos estos factores tienen influencia en la fisiología de la diatomea y potencialmente en la producción de ácido domoico. Otras productoras de ácido domoico, como son Pseudonitzsch

Figura 3.7. Arriba, corte transversal de las valvas de una diatomea. Abajo, estructura de la frústula a 850 aumentos. Tomado de THOMAS-DOMENECH, J.M. Atlas de Botánica. Jover. Barcelona, 1983.

Las diatomeas planctónicas presentan una gran variedad de formas, cada una de ellas adaptada a su modo para que la relación superficie/volumen sea elevada. Se pueden agrupar en cuatro grandes categorías: - En forma de pastillero. Normalmente circulares y con simetría radial, vistas por su parte superior e inferior, por ejemplo Coscinodiscus y Hialodiscus . A veces están ligadas por prolongaciones protoplasmáticas y forman cadenas, por ejemplo Thalassiosira y Coscinosira . - En forma de bastón o de aguja. La división entre las valvas puede ser en ángulo recto al eje longitudinal de la célula, por ejemplo Rhizosolenia , y suelen encontrarse unidas extremo con extremo para formar cadenas rectas. En otras especies la división se produce en sentido longitudinal, por ejemplo, Thalassiothrix y Asterionella , y pueden estar unidas forman agrupaciones con forma de estrella o cadenas irregulares en zig-zag. - En forma de filamento. Células unidas por la superficie de las valvas para crear cade

Las céntricas con sus espermatozoides flagelados, deben ser consideradas como más primitivas que las pennadas, las cuales han perdido por completo los flagelos. Como antepasados de las diatomeas se puede pensar ante todo en las crisomonadales, cuyos cistes también poseen membranas silificadas. Las diatomeas han quedado limitadas al estado cocal, por la formación de cadenas en algunas especies conduce hacia la forma trical. Las diatomeas más antiguas que se conocen, ciertamente formas céntricas, corresponden al jurásico. A partir del Cretácico existió ya una gran riqueza de especies. En el terciario y en los interglaciares el desarrollo de diatomeas marinas determinó incluso la formación de rocas (tierra de diatomeas).

Las diatomeas comprenden unas 1.000 especies y se hallan difundidas en las aguas bajo todos los climas y algunas formas también viven en tierra húmeda. Prefieren las aguas de reacción débilmente alcalina. Las céntricas viven sobre todo en el mar y son uno de los componentes principales del fitoplancton. Muchas diatomeas planctónicas poseen apéndices especiales que las ayudan a flotar o se unen en cadenas o de otra manera mediante gelatina. Las céntricas carecen de movimiento propio. Las diatomeas pennadas, muchas veces móviles, viven en aguas dulces, salobres o salinas (a veces se desarrollan en masa) y suelen hallarse descansando en el fondo; otras veces se desarrollan como epifitos sobre plantas acuáticas, pero también han desarrollado formas planctónicas.

Sus células son bacilares o naviculares, raramente cuneiformes. El centro de simetría se ha transformado entonces en una línea, del que parten los relieves que ofrecen, en conjunto, aspecto de pluma. En un gran número de especies sigue la línea de simetría una estría longitudinal o “rafe”, cuya constitución exacta varía mucho según los géneros; se admite que en este sitio el plasma sale al exterior y origina un movimiento de reptación particular, que sólo se observa en las diatomeas pennadas. Generalmente en la reproducción sexual de las pennadas se copulan entre sí dos isogametas carentes de flagelos. En el apareamiento se acoplan dos células vegetativas y segregan gran cantidad de pectina gelatinosa. El núcleo de cada célula se divide, mediante meiosis, en cuatro núcleos haploides, dos de los cuales degeneran. Así se originan en cada célula dos gametas en forma de protoplastos desnudos. Entonces se abren las valvas, los gametas se copulan dos a dos y se originan dos cigotos, los que,

Las frústulas tienen contornos circulares o triangulares redondeados y las esculturas de los mismos presentan ordenación radial o concéntrica. A diferencia de las pennadas, las céntricas carecen de capacidad de locomoción. La reproducción sexual se realiza mediante meiogametos; en las células masculinas se forman mediante meiosis, cuatro espermatozoides y en otras células, generalmente de mayor tamaño, transformadas en oogonios, ovocélulas. Los espermatozoides poseen un flagelo con bárbulas. La determinación del sexo se produce con carácter de modificación. En concreto pueden darse varias variaciones. Es posible, por ejemplo, que en los oogonios se conserven dos de los cuatro núcleos de los gonios o uno solo, de modo que se formen dos ovocélulas o solamente una. Estas pueden salir al agua exterior o permanecer dentro del oogonio, aligando al espermatozoide a penetrar por una fisura entre las valvas. En el sexo masculino la célula vegetativa puede pasar directamente a actuar como anter

Las diatomeas se reproducen por bipartición. Para ellos, las valvas se desencajan una de otra por el empuje del cuerpo plasmático, que aumentan de tamaño; cada una de las dos células hijas produce una nueva hipoteca. Una de las células hijas adquiere pues el mismo tamaño que la célula madre, pero la otra queda más pequeña; repitiéndose las divisiones, esto conduce a una disminución progresiva de dimensiones, que continúa hasta un determinada mínimo, al alcanzar el que se realiza la reproducción sexual, unida a un extraordinario aumento de volumen del zigoto. Algunas especies pueden oponerse a la reducción progresiva del tamaño debido a que sólo vuelve a dividirse la mayor de las células hijas; en otras, las pleuras poseen cierta elasticidad, de modo que la diferencia de tamaño entre epiteca e hipoteca resulta muy pequeña. Según la simetría de la frústula, las diatomeas se dividen en dos subórdendes: Centricae y Pennatae . En las primeras, las frústulas son radiadas, mientras que en la

Las diatomeas son seres vivos unicelulares, que pertenecen filogenéticamente al filum Chyrsophyta . A veces se unen en filas o fascículos, comprendiendo este grupo gran cantidad de formas. Poseen pigmentos y sustancias de reserva característicos de las crisofíceas, ocupando una particular posición ya que poseen dos valvas silíceas que se constituyen al exterior de la membrana plasmática. Una de dichas valvas, la epiteca, encaja exteriormente como la tapadera de una caja sobra la otra, denominada hipoteca. Cada una de ellas recibe el nombre de teca o valva, mientras sus partes laterales reciben el nombre de pleuras. Por lo tanto, la célula ofrece dos aspectos distintos, según se mire por el lado de las valvas, es decir, por arriba o por debajo o por el lado pleural, es decir, por el flanco. Entre las valvas, en la zona pleural, se intercalan a veces piezas intermedias, que en algunas especies originan septos que se adentran en el interior de la célula. La envoltura, denominada frústula,

En algunos países de Europa, como Francia y España, el cultivo de mejillones o miticultura tiene gran importancia económica. En España se hace el cultivo mediante tres procedimientos: empalizadas, estanques y balsas flotantes, siendo este último el más difundido, por los óptimos resultados que se obtienen debido a las características de las costas y al régimen de mareas. Sus principales parques de cultivo se encuentran en las vías gallegas, costas de Galicia y Cantabria y en los puertos de Barcelona y Valencia; se cultivan de 300 a 400 mil toneladas anuales. Las especies más frecuentes cultivadas en España, Francia y Holanda, son el mejillón común y el mejillón rubio. En el Mediterráneo se cultiva el mejillón en Tarento y otros puntos de Italia, en donde se llama "cozze mere" al Mytilus edulis y "cozze pelose" al Mytilus barbatus. En menor proporción se cultivan en Inglaterra, Italia, Portugal, Noruega, Escocia, Alemania y Yugoslavia; en América Latina la miticultur

A continuación se describirán los pasos que conducen a la introducción de la Toxina Amnésica de los Moluscos en la alimentación humana. El primer paso son los nutrientes del agua marina: nitrógeno, fósforo, y fundamentalmente silicio, ya que es el componente fundamental de la frústula de las diatomeas. Éstas son el segundo paso, las diatomeas del género Pseudonitzschia son las productoras de la Toxina Amnésica de los Moluscos (ASP), sirviendo de alimentación a los moluscos, que pueden ser de vida libre o cultivados, como los mejillones, que son el tercer paso. El cuarto paso es la alimentación humana a base de estos moluscos contaminados por la toxina. Se explicará cada una de las partes, desde la alimentación humana, poniendo en este caso, como ejemplo al mejillón, hasta los nutrientes de las diatomeas. Figura 3.1. Diagrama de las fases que conducen a un intoxicación alimentaria por ASP.

Este tipo de marea roja se detectó por primera vez en el Este del Canadá en el invierno 1987/88, a raíz del consumo de mejillones azules cultivados, se vieron afectadas más de 150 personas y se produjeron 4 muertes. Estos moluscos que se habían contaminado con la Toxina Amnésica de los Moluscos (ASP, Amnesic Shellfish Poisoning (Wright et al, 1989). La muerte de pelícanos y cormoranes que se había observado en California en 1991 fue explicada por la transferencia trófica de esta toxina desde anchoitas que se habían alimentado con diatomeas productoras de ácido domoico (Work et al, 1993). Desde entonces en diferentes lugares del mundo se ha detectado la presencia de estas toxinas. En 1998, en la costa de California, se produjo el florecimiento de la diatomea tóxica Pseudonistzchia australis, produciendo la muerte de 400 leones marinos, determinándose que esta mortandad fue originada por la ingesta de anchoitas (Engraulis mordax) que contenían ácido domoico (Scholin et al, 2000). La Tox

3.1. Mareas rojas y Toxina amnésica de los Moluscos (ASP) 3.2. El ciclo de introducción de la ASP en la cadena alimentaria humana 3.3. Importancia del cultivo del mejillón 3.4. Las diatomeas 3.5. El silicio y otros nutrientes

La localización del ácido domoico en el sistema digestivo de las almejas tiene claramente un origen en el tipo de dieta a través de del plancton. Las glándulas digestivas de las almejas tóxicas estaban llenas de plancton, que al ser examinado el microscopio reveló la presencia de una diatomea sin identificar. Los biólogos marinos encontraron en el plancton del estuario un alga identificada como la diatomea Pseodonitzschia pungens. Posteriormente se estableció inequivocadamente que el ácido domoico era un producto secundario en el metabolismo de esta diatomea. Era la primera vez que se describía una toxina en mariscos teniendo como origen una diatomea marina con implicaciones en la industria pesquera tan significativas. La diatomea Pseudonitzschia pungens está muy débilmente distribuida por las costas del Atlántico, Pacífico y Océano Índico. La causa por la que esta diatomea aparece en el mar está relacionada con el hecho de que en la época de desarrollo en la costa es arrastrada por el

El estudio de todas las fracciones demostró que el ácido domoico era el único producto responsable de la toxicidad. Pacientemente, en los siguientes días, con ácido domoico purificado se llevaron a cabo bioensayos para conocer la curva de toxicidad. Figura 1.12.- Curva de dosis-respuesta, trazada como tiempo de muerte (TOD) contra dosis de ácido domoico (determinado por análisis HPLC), para soluciones estándar y para diferentes extractos contaminados de almejas inyectados a ratones. Cada punto es el resultado de 2-4 respuestas reproducibles de TOD para una solución, y la barra de error representa una muestra de la desviación estándar. La curva es un polinomio de segundo orden, obtenido por regresión por mínimos cuadrados para todos los puntos. La figura anterior muestra dicha curva obtenida inyectando ácido domoico puro y cantidades equivalentes de extracto de almejas tóxicas con metanol/agua y con HCl. Se representa frente a 1/t en minutos. Hay una dosis terapéutica, inferior a 50 mg,

Una vez que se llegó a este punto se pudo confirmar que el compuesto tóxico es el ácido domoico o alguno similar. Mediante NMR se realiza una prueba inequívoca. Se necesita para ello disponer de sustancia pura suficiente. La técnica FT-IR ayuda también a este fin. Por repetitivas, HPLC, se recogen fracciones del compuesto tóxico y se purifican. El espectro de C13-NMR coincide con uno publicado para el ácido domoico sintético. Se determina el punto de ebullición, fusión y dispersión rotatoria óptica, coincidiendo con los del ácido domoico. El ácido domoico es un ácido tricarboxílico, soluble en agua y termoestable

El espectro de masas muestra un pico a m/z 312 en el modo de iones positivos y m/z (M-H-) a 310 para iones negativos. Este pico se incrementa en altura a medida que se va purificando la toxina. No existe un espectro de masas igual para las fracciones de almejas control. Los iones fragmentados parecen indicar pérdidas de H-COOH, así como otras pequeñas moléculas neutras, que dan un fragmento intenso a 74 (m/z). Por antecedentes bibliográficos y por las pistas de las experiencias anteriores, este espectro es característico de un aminoácido protonado. Realizando la técnica FAB-MS/MS, e introduciendo las especies de los picos del primer MS en un segundo MS, se deduce que el compuesto tienen una fórmula molecular: C15H22NO6 También se llega a esta conclusión con la ayuda de los espectros FT-IR de las reacciones tóxicas. Este espectro sugiere en la molécula la presencia de los siguientes grupos: =NH -C

Todas las fracciones donde aparece el compuesto tóxico son estudiadas por FAB-MS, masas con bombardeo con átomos rápidos. En las figuras siguientes se pueden ver los datos espectroscópicos de la toxina de las almejas. Figura 1.9.- Espectro de masas MS/MS a m/z 312 en el espectro de masas FAB en el modo de iones positivos de una fracción tóxica XAD-2. Figura 1.10.- Espectro FT-IR de un film delgado de la toxina aislada sobre una ventana de CaF2 . Figura 1.11.- Espectro de protón NMR a 300 MHz de la toxina purificada disuelta en D2O.

Figura 1.5.- Cromatograma reconstruido para los datos DAD a 242 nm , que corresponde a los mejillones tóxicos. Condiciones: 25 cm x 4,6 mm i.d. Columna Vydac 20 1TP con 1,0 ml/min CH3CN/CF3COOH; gradiente de elución de 5,0:94,9:0,1 a 99,9:0:0,1 por encima de 40 min. Figura 1.6.- Cromatograma reconstruido para los datos DAD a 242 nm , que corresponde a los mejillones de control. Condiciones: 25 cm x 4,6 mm i.d. Columna Vydac 20 1TP con 1,0 ml/min CH3CN/CF3COOH; gradiente de elución de 5,0:94,9:0,1 a 99,9:0:0,1 por encima de 40 min. Como se observa en las anteriores figuras, a 242 nm las diferencias se muestran con muchísima intensidad. Lo que se pueden comprobar en las figuras siguientes. Figura 1.7.- Diagrama tridimensional, que relaciona longitud de onda, tiempo y absorbancia. El pico de la izquierda corresponde al triptófano Figura 1.8.- Diagrama absorbancia-longitud de onda. El máximo se produce a 242 nm. Al realizar los cromatogramas de dos fracciones extractivas con HPLC-DAD, en

Para el caso de que la toxina fuera lábil, inicialmente se seleccionó un procedimiento clásico de extracción para productos naturales. El método era extracción con mezclas alcohol/agua a temperatura ambiente. Los mejores resultados se obtuvieron posteriormente llevando a cabo una posterior extracción del residuo, después de la evaporación con una mezcla diclorometano-agua, con lo que se obtienen dos fases, la acuosa y la orgánica. La separación cromatográfica de la fase acuosa a través de una columna XAD-2 reveló que la toxina era soluble en agua. La etapa final del proceso de purificación se realizó por dos métodos separativos basados en propiedades fisicoquímicas distintas. El HPLC se basa en la diferente partición o reparto de los analitos entre una fase móvil polar y una fase estacionaria no polar, mientras que la electroforesis en papel de alto voltaje (HVPE) las separaciones dependen de la diferente movilidad de las especies cargadas bajo un fuerte campo eléctrico. Las fracciones

Figura 1.1. - Este diagrama de flujo muestra (a) los principios generales la estrategia del análisis por bioensayo directo y (b) los procedimientos de extracción y fraccionamiento usados en la investigación de los mejillones tóxicos (almejas tóxicas, según la traducción literal del inglés al castellano). La estrategia con biosensayos directos fue la siguiente: - Se obtuvieron extractos en paralelo de mejillones tóxicos y de control y a través de una serie de etapas de separación se van diferenciando los componentes y las fases. - Se utiliza una parte de cada fracción separada para bioensayos en ratones y determinar de esta manera en que proporción se encuentra la sustancia o las sustancias tóxicas. - Los círculos en negro indican positivo en la prueba. - Todas las fracciones, tanto de mejillones tóxicos como de control, son analizadas por diferentes técnicas analíticas, cromatográficas y espectroscópicas. - Se pretende comparar las “huellas” cromatográficas y espectroscópicas de las fr

Varios laboratorios, preparados para análisis de sustancias tóxicas, como son metales pesados y pesticidas organofosforados, abordaron el estudio del problema, pero sus resultados fueron negativos. Los experimentos individuales se centraron en comparar las huellas analíticas de los extractos obtenidos con mejillones tóxicos y mejillones no tóxicos. Una diferencia en los cromatogramas o en los espectros de los extractos podría atribuirse entonces al agente tóxico que provocaba el síndrome. Los métodos analíticos que buscaban estas diferencias incluían: - TLC (cromatografía en capa fina) - HPLC con detección HV-V o DAD (diode array detector) - GC/MS - FT-IR - Espectrometría NMR. Inicialmente se observaron algunas diferencias, tanto en TLC como en HPLC-DAD en la parte liposoluble (extractos en disolventes no polares) de las glándulas digestivas de los mejillones tóxicos y de las mejillones de control. Las fracciones diferenciadoras tenían espectros