2.4. ESTRATEGIAS CROMATOGRÁFICAS (I)
Para el caso de que la toxina fuera lábil, inicialmente se seleccionó un procedimiento clásico de extracción para productos naturales. El método era extracción con mezclas alcohol/agua a temperatura ambiente. Los mejores resultados se obtuvieron posteriormente llevando a cabo una posterior extracción del residuo, después de la evaporación con una mezcla diclorometano-agua, con lo que se obtienen dos fases, la acuosa y la orgánica.
La separación cromatográfica de la fase acuosa a través de una columna XAD-2 reveló que la toxina era soluble en agua.
La etapa final del proceso de purificación se realizó por dos métodos separativos basados en propiedades fisicoquímicas distintas.
El HPLC se basa en la diferente partición o reparto de los analitos entre una fase móvil polar y una fase estacionaria no polar, mientras que la electroforesis en papel de alto voltaje (HVPE) las separaciones dependen de la diferente movilidad de las especies cargadas bajo un fuerte campo eléctrico.
Las fracciones positivas en HPLC se confirman por HVPE y viceversa, para minimizar errores. Ambas técnicas dan además información sobre la naturaleza del compuesto tóxico.
Algunos de los resultados obtenidos de perfiles HPLC-DAD de las correspondientes fracciones XAD-2 para mejillones tóxicos y de control podemos observarlos en las figuras siguientes.
La separación cromatográfica de la fase acuosa a través de una columna XAD-2 reveló que la toxina era soluble en agua.
La etapa final del proceso de purificación se realizó por dos métodos separativos basados en propiedades fisicoquímicas distintas.
El HPLC se basa en la diferente partición o reparto de los analitos entre una fase móvil polar y una fase estacionaria no polar, mientras que la electroforesis en papel de alto voltaje (HVPE) las separaciones dependen de la diferente movilidad de las especies cargadas bajo un fuerte campo eléctrico.
Las fracciones positivas en HPLC se confirman por HVPE y viceversa, para minimizar errores. Ambas técnicas dan además información sobre la naturaleza del compuesto tóxico.
Algunos de los resultados obtenidos de perfiles HPLC-DAD de las correspondientes fracciones XAD-2 para mejillones tóxicos y de control podemos observarlos en las figuras siguientes.
Figura 1.3.- Cromatograma reconstruido para los datos DAD a 210 nm , que corresponde a los mejillones tóxicos. Condiciones: 25 cm x 4,6 mm i.d. Columna Vydac 20 1TP con 1,0 ml/min CH3CN/CF3COOH; gradiente de elución de 5,0:94,9:0,1 a 99,9:0:0,1 por encima de 40 min.
Figura 1.4.- Cromatograma reconstruido para los datos DAD a 210 nm , que corresponde a los mejillones de control. Condiciones: 25 cm x 4,6 mm i.d. Columna Vydac 20 1TP con 1,0 ml/min CH3CN/CF3COOH; gradiente de elución de 5,0:94,9:0,1 a 99,9:0:0,1 por encima de 40 min.
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